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      好文推薦!副豬嗜血杆菌與豬鏈球菌混合感染案例分析
      江西某豬場保育仔豬和産房仔豬出現嚴重的關節腫脹、跛行、行動困難等現象,對發病仔豬進行剖檢,取病變組織進行病原學鑒定,結果鑒定出有鏈球菌和副豬嗜血杆菌。
      好文推薦!副豬嗜血杆菌與豬鏈球菌混合感染案例分析

      江西某豬場保育仔豬和産房仔豬出現嚴重的關節腫脹、跛行、行動困難等現象,對發病仔豬進行剖檢,取病變組織進行病原學鑒定,結果鑒定出有鏈球菌和副豬嗜血杆菌。對病料進行細菌的分離培養,結果分離出了鏈球菌及副豬嗜血杆菌。結合臨床症狀、病理變化和實驗室診斷,確診爲豬鏈球菌和副豬嗜血杆菌混合感染。

      豬鏈球菌病是由D、E、L群鏈球菌以及豬鏈球菌等引起的豬的疫病的總稱,臨床上主要表現爲淋巴結膿腫、腦膜炎、關節炎以及敗血症等症狀。豬鏈球菌病也是人獸共患傳染病,嚴重危害生物安全及公共衛生。

      副豬嗜血杆菌病是由副豬嗜血杆菌引起的豬的多發性漿膜炎和關節炎,主要症狀爲發熱、咳嗽、心包炎、腹膜炎、關節炎和腦膜炎等。副豬嗜血杆菌病主要在斷奶後和保育階段發病,發病率一般在10% ~ 15%,嚴重時死亡率可達50%。

      01

      發病情況及臨床症狀

      江西某豬場仔豬陸續出現行動困難、跛行、蹄不著地等症狀,仔豬四肢關節出現不同程度的腫大,觸診有波動感,有的豬的關節按壓時有摩擦感,用力按壓豬有疼痛感。剖檢發現心包有積液,肺髒有部分淤血。劃開後肢關節有大量的黃色膿性滲出物,關節腔內有黃色積液,關節囊、滑膜嚴重增生,關節腔內出血充血嚴重,且有炎性增生(圖1)。

      圖1 送檢仔豬的臨床症狀及病理變化。(A)仔豬後肢關節腫脹(B)劃開關節皮膚,有大量化膿性滲出物(C)關節腔內有黃色積液,關節囊、滑膜嚴重增生,關節腔內出血充血嚴重,且有炎性增生。

      02

      實驗室診斷

      2.1 材料

      2.1.1 血樣采集

      對2頭發病仔豬進行前腔靜脈采血5 mL,析出血清,用于血清學診斷

      2.1.2 仔豬剖檢

      對2頭發病仔豬進行病理剖檢,分別剪取出肺髒、腹股溝淋巴結、脾髒等病變組織並收集心包液、關節液及關節膿性滲出物,用于細菌的分離培養和PCR鑒定

      2.1.3 培養基及試劑

      大豆酪蛋白瓊脂培養基(TSA,廣東環凱微生物科技有限公司)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、胎牛血清、血平板、革蘭氏染色液、2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(GenStar)、病毒DNA/RNA提取試劑盒(Magen)、RT-PCR試劑(Takara)

      2.1.4 藥敏試驗材料

      環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、卡那黴素、替米考星、磺胺甲惡唑、大觀黴素、氨苄西林鏈黴素、新黴素、慶大黴素、阿莫西林、氟苯尼考、頭孢曲松、頭孢拉定、萬古黴素、四環素共17種藥敏試紙均購于OXOID公司

      2.2 方法

      2.2.1 PCR鑒定

      2.2.1.1 引物合成

      參考NCBI上豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬鏈球菌、副豬嗜血杆菌特異蛋白的基因序列,用Primer 5.0 軟件分別設計了它們具有高特異性和敏感性的引物,對分離到的疑似豬藍耳病毒、鏈球菌和副豬嗜血杆菌進行PCR鑒定,引物序列及擴增片段長度,由蘇州泓迅生物科技有限公司合成(表1)。

      表1 豬鏈球菌及副豬嗜血杆菌引物設計

      2.2.1.2 PCR模板

      病料DNA/RNA提取:剪取病變明顯的部位,放入裝有磁珠的EP管中,加入500 μL的PBS,組織破碎儀將組織磨碎,之後按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書進行基因組提取:用接種環勾取單個純化培養後的菌落,加入到500 μL的液體培養基中,37 ℃搖菌過夜,以此作爲PCR反應的模板。同時做陽性對照及陰性對照。

      2.2.1.3 PCR反應體系及反應條件

      豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-PCR反應體系:病毒RNA的反轉(10 μL):RNA模板2 μL ,5×Buffer 2 μL,反轉引物(GP5-R1) 0.5 μL,dNTP 0.5 μL,RNase inhibitor 0.25 μL,RTass M-MLV 0.5 μL,ddH2O 4.25 μL;一次PCR體系(20 μL):反轉cDNA 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下遊引物(GP5-F1/R1)各1 μL,ddH2O 6 μL;二次PCR反應體系(20 μL):第一次PCR産物 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下遊引物(GP5-F2/R2)各1 μL,ddH2O 7 μL。

      豬繁殖與呼吸綜合征病毒套式PCR反應條件爲94 ℃預變性2 min;一次PCR 94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸55 s,30個循環;二次PCR 94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸55 s,30個循環;72 ℃再延伸5 min。

      副豬嗜血杆菌套式PCR反應體系:一次PCR體系(20 μL):菌體(病料)DNA 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下遊引物(HPS-Outer-F/R)各1 μL,ddH2O 6 μL;二次PCR反應體系(20 μL):第一次PCR産物 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下遊引物(HPS-Inner-F/R)各1 μL,ddH20 7 μL。

      副豬嗜血杆菌PCR反應條件爲94 ℃預變性2 min;一次PCR 94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,30個循環;二次PCR 94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,30個循環;72 ℃再延伸5 min。

      豬鏈球菌PCR反應體系(20 μL):菌體(病料)DNA 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下遊引物(SS-F/R)各1 μL,ddH2O 6 μL。

      豬鏈球菌PCR反應條件爲94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,30個循環;72 ℃再延伸5 min。

      經5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR産物大小。

      2.2.2 細菌分離培養

      首先配制TSA平板(加有5%胎牛血清和1% NAD),將剪取的病變組織塗抹于TSA平板和血平板上,用接種環劃線後置于37 ℃培養箱培養24 ~ 48 h,觀察菌落形態,並挑取單菌落進行純化培養。

      2.2.3 革蘭氏染色鏡檢

      挑取純化培養後的單菌落塗片,將塗片在火焰上固定,滴加結晶紫染色液,染1 min,水洗;滴加革蘭氏碘液,1 min,水洗;滴加脫色酒精,約30 s;水洗後滴加沙黃複染液,複染1 min,水洗,待幹,顯微鏡下觀察細菌的形態特點。

      2.2.4 藥敏試驗

      挑取純化培養的單個菌落加入500 μL的無菌培養基中37 ℃搖至培養基渾濁,離心後吸去部分上層液,取200 μL菌液至TSA平板中,用玻璃棒塗抹均勻,隨後貼上各種藥敏紙片,37 ℃培養24 ~ 48h,用直尺測量抑菌圈的直徑,依據藥品說明書判定結果(表2)。

      表2 藥敏實驗判定標准

      03

      結果

      3.1 病料的PCR鑒定

      由PCR電泳圖可知,用豬繁殖與呼吸綜合征病毒套式PCR引物在發病仔豬解剖後的淋巴結、肺均未擴增出914 bp陽性條帶,提示未檢測到藍耳抗原(圖2);用副豬嗜血杆菌PCR套式引物在發病仔豬解剖後的肺、心包液、腹股溝淋巴結及腫脹關節液等樣品中擴增出197 bp陽性條帶,提示檢測到副豬嗜血杆菌抗原(圖3);用豬鏈球菌PCR引物在發病仔豬解剖後關節膿性滲出物、腹股溝淋巴結及腫脹關節液擴增出207 bp陽性條帶,提示檢測到鏈球菌抗原(圖4)。

      圖2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒PCR鑒定結果。M:DNA分子Marker;“+”表示陽性對照,“-”表示陰性對照;編號前面3和5爲發病仔豬耳號第一位數字;陽性條帶爲914 bp。

      圖3 副豬嗜血杆菌PCR鑒定結果。M:DNA分子Marker;“-”表示陰性對照;編號前面3和5爲發病仔豬耳號第一位數字;陽性條帶爲197 bp。

      圖4 豬鏈球菌PCR鑒定結果。M:DNA分子Marker;“+”表示陽性對照,“-”表示陰性對照;編號前面3和5爲發病仔豬耳號第一位數字;陽性條帶爲207 bp。

      3.2 細菌的分離培養

      將檢測到含有副豬和鏈球菌病料深層組織接種在TSA培養基(5%胎牛血清+1%NAD)上分區劃線培養24 ~ 48 h,在塗有發病仔豬的關節液和關節膿性滲出物的TSA平板上均長出了針尖大小、無色透明、邊緣光滑整齊、濕潤的菌落。同時塗有關節膿性滲出物的血平板上出現了明顯的 β 溶血環,爲 β 溶血(圖5)。挑單菌落進行塗片及革蘭氏染色鏡檢,發現關節膿性滲出物中的細菌鏡下呈紫色,爲革蘭氏陽性菌;關節液中的細菌鏡檢呈紅色,爲革蘭氏陰性菌(表3)。

      圖5 關節膿性滲出物在血平板上的菌落形態

      3.3 細菌PCR鑒定

      將TSA平板及血平板上的菌落純化培養後進行細菌的PCR鑒定,挑出純化的關節膿性滲出物的菌落用豬鏈球菌特異性引物均擴增出了207 bp大小的條帶,大小與目的片段一致,結合菌落出現 β 溶血及革蘭氏陽性菌,可判定爲溶血性鏈球菌。挑出的純化後關節液形成的菌落用副豬特異性引物均擴增出197 bp大小的條帶,結合TSA上的菌落形態及革蘭氏陰性菌,可判定爲副豬嗜血杆菌(表3)。

      表3 細菌分離培養後對菌落進行鑒定

      3.4 藥敏試驗

      對該豬場病豬分離到的副豬嗜血杆菌和豬鏈球菌進行藥敏試驗,結果如表所示(表4、表5、圖6)。

      表4 鏈球菌抑菌圈的測量結果(單位:mm)

      表5 副豬嗜血杆菌抑菌圈的測量結果(單位:mm)

      結果顯示,所分離得到的鏈球菌對慶大黴素、阿莫西林、萬古黴素高敏,對頭孢曲松、頭孢拉定極敏;分離所得的副豬嗜血杆菌對恩諾沙星、氧氟沙星、四環素高敏,對環丙沙星、阿莫西林、氟苯尼考、頭孢曲松、頭孢拉定、磺胺甲惡唑、萬古黴素、氨苄西林極敏。

      圖6 部分藥敏試驗抑菌圈直徑大小

      04

      結論

      結合該豬場發病豬的臨床症狀及病理變化,並對2頭發病仔豬解剖進行實驗室診斷,解剖2頭發病仔豬,肺、心包液、腹股溝淋巴結及腫脹關節液檢測到副豬;化膿、腹股溝淋巴結及腫脹關節液檢測到鏈球菌。對鏈球菌和副豬進行細菌分離培養,通過對菌落形態、革蘭氏染色及純化後菌液PCR鑒定,進一步確診了該豬場發病豬爲副豬嗜血杆菌和溶血性鏈球菌混合感染。通過對鏈球菌和副豬做藥敏實驗,綜合考慮,建議采用以下抗生素治療:阿莫西林、慶大黴素、氟苯尼考及氨苄西林(聯合使用),對發病豬只肌注給藥,並對産房仔豬進行飲水、飼料拌藥保健。

       

      作者簡介

      郭春和:獸醫博士,主要從事疫病檢測防控及藍耳病研究,以第一作者發表7篇SCI,總IF>14,申報國家發明專利8項,3項已授權。

      原標題:副豬嗜血杆菌與豬鏈球菌混合感染案例分析

      文|郭春和1,朱振邦1,劉娜2,陳瑤生1,劉小紅1

      1. 中山大學生命科學學院 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室;

      2. 肇慶農業學校

      摘自《豬業》2017年第1期

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